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過表達慢病毒的制備方法

更新時間:2024-12-10 點擊量:311
  過表達慢病毒是一種基于慢病毒載體的基因傳遞系統(tǒng)。慢病毒是一類單鏈RNA病毒,其基因組可以整合到宿主細胞的染色體上,從而實現(xiàn)長期穩(wěn)定的基因表達。通過將目的基因克隆到慢病毒載體中,利用慢病毒的包裝質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染到包裝細胞中,經(jīng)過包裝、成熟和釋放等過程,獲得含有目的基因的慢病毒顆粒。這些慢病毒顆粒可以感染宿主細胞,將目的基因整合到宿主細胞的染色體上,實現(xiàn)目的基因的過表達。
 
  過表達慢病毒的制備方法:
 
  1.目的基因的克隆:需要將目的基因克隆到慢病毒載體中。常用的慢病毒載體有pLenti6/V5-DEST、pLenti-CMV/TO-Puro-DEST等。將目的基因插入到慢病毒載體的多克隆位點,構(gòu)建重組質(zhì)粒。
 
  2.包裝細胞的培養(yǎng):常用的包裝細胞有293T、293FT等。將這些細胞培養(yǎng)至適當(dāng)?shù)拿芏龋员阌诤罄m(xù)的轉(zhuǎn)染實驗。
 
  3.轉(zhuǎn)染實驗:將重組質(zhì)粒與慢病毒的包裝質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染到包裝細胞中。常用的轉(zhuǎn)染方法有磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法等。
 
  4.病毒收集與純化:轉(zhuǎn)染后48-72小時,收集包裝細胞上清液,通過超速離心、過濾等步驟,純化得到高滴度的慢病毒顆粒。
 
  5.病毒滴度測定:通過熒光定量PCR、流式細胞術(shù)等方法,測定慢病毒顆粒的滴度,以便后續(xù)的感染實驗。
 
  過表達慢病毒的應(yīng)用:
 
  1.基因功能研究:通過感染宿主細胞,實現(xiàn)目的基因的過表達,從而研究該基因在細胞生長、凋亡、分化等過程中的作用。
 
  2.藥物篩選:通過感染腫瘤細胞,建立穩(wěn)定的藥物篩選模型,用于抗腫瘤藥物的篩選和評價。
 
  3.基因治療:通過感染患者細胞,實現(xiàn)目的基因的過表達,從而達到治療疾病的目的。例如,可以用于治療遺傳性疾病、免疫缺陷病等。
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